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關(guān)鍵詞:慧穎生物提供高品質(zhì)Anip973細胞,人肺腺癌細胞株,狀態(tài)良好,傳代次數(shù)靠前,*!
產(chǎn)品名稱:Anip973細胞,人肺腺癌細胞株
規(guī)格:凍存管/25T培養(yǎng)瓶
貨期:10個工作日左右
質(zhì)量標準:無支原體,無污染
上海慧穎生物提供4000多種類細胞株細胞系,從源頭把控產(chǎn)品的可靠性,復蘇,凍存,傳代,培養(yǎng),嚴格無菌操作,全國各地均可發(fā)貨,遠到香港,澳門,內(nèi)蒙古,新疆石河子,寧夏,海南等地,全國訂購:!
原代細胞培養(yǎng)成功以后,需要進行分離培養(yǎng),否則細胞會因生存空間不足或密度過大,營養(yǎng)障礙,影響細胞生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細胞允許培養(yǎng)的細胞擴增(形成細胞株),可以進行細胞克隆,易于保存,但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征。傳代Anip973細胞,人肺腺癌細胞株形成細胞株的zui大利處在于提供了大量持久的實驗材料,便于實驗。1. 操作步驟(1)吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。(2)向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。(3)置37℃孵箱或室溫(25℃溫度)下進行消化,2~5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察,當發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后,應(yīng)立即中止消化。(4)吸出消化液,向瓶內(nèi)加入Hanks液少量,輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,把殘留消化液沖掉,然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化,在吸除胰蛋白液后,可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液,終止消化。(5)使用彎頭吸管,吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔,以防用力過猛損傷細胞。(6)用計數(shù)板計數(shù)后,分別接種于新的培養(yǎng)瓶中,置CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。(7)細胞培養(yǎng)換液時間應(yīng)根據(jù)細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2~3d后應(yīng)換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面,即可使用;也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。2. 注意事項(1)掌握好細胞消化的時間,消化時間過短時,細胞不宜從瓶壁脫落,過長的消化會導致細胞脫落、損傷。(2)掌握好消化濃度,當消化液濃度過高時,消化時間應(yīng)縮短,過低時細胞消化時間相對延長。三、體內(nèi)細胞培養(yǎng)及其操作步驟1. 瘤細胞懸液接種(1)無菌選取生長良好(有光澤,淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)瘤細胞。 (2)在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨,經(jīng)80~100目篩網(wǎng)過濾成細胞懸液。(3)培養(yǎng)細胞應(yīng)用PBS洗兩遍。(4)計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至107~108/ml。(5)常規(guī)消毒后,于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細胞懸液(0.1ml/部位,>106細胞)。初次接種成功率低,細胞數(shù)盡可能多一些。(6)次日注意觀察動物一般情況。初次接種一般有一段較長的潛伏期,以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短,zui后固定為一個相對穩(wěn)定的時間。2. 腹水瘤的建立與腹水瘤的接種 將實體瘤細胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位,引起腹水,腹水中含有瘤細胞,將這種腹水反復傳代,即可成為腹水瘤。初次傳代時,腹水常呈血性(含大量紅細胞),反復傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下。(1)將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細胞離心和洗滌,進行細胞計數(shù)。(2)消毒動物,左下腹穿刺接種106腹水瘤細胞。(3)接種腹水瘤細胞后約7~12d,待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部,用9號針頭抽取腹水,也可行腹部解剖后,用滴管吸取。每只小鼠可抽3~5ml。(4)抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min,收集上清,分裝凍存?zhèn)溆谩K摹⑴囵B(yǎng)細胞的凍存及復蘇細胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細胞凍存在-196℃液氮中,儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。1. 凍存細胞(1)選對數(shù)增生期細胞(證明無支原體污染),在凍存前1d換液。(2)按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制備成懸液,計數(shù),使細胞密度達5×107/ml左右密度,離心,去上清。(3)加入配制好的凍存液(培養(yǎng)液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10%二甲基亞砜(DMSO) 或甘油,可使冰點降低,使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外。(4)分裝于無菌凍存管中,每管加1.5m懸液。(5)旋好凍存管并仔細檢查,一定要蓋緊,做好標記。(6)凍存:在特殊的儀器或簡易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40min時間內(nèi),下降到液氮表面,再停30min后,直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度,過快能影響細胞內(nèi)水分透出,太慢則促進冰晶形成。操作時應(yīng)戴防護眼鏡和手套,以免液氮凍傷。2. 復蘇細胞(1)從罐中取出凍存管。(2)迅速放入36℃~37℃水浴,不時搖動,使其急速融化,30~60s內(nèi)完成。(3)凍存管用70%酒精擦拭消毒后,打開蓋子,用吸管將細胞懸液注入離心管中,再滴加10ml培養(yǎng)液。(4)低速離心(500~1000r/min) 5min,去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。(5)用培養(yǎng)液適當稀釋后,裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng),次日更換一次培養(yǎng)液后,繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進行培養(yǎng)。凍存細胞數(shù)量要充分,密度應(yīng)達到107/ml,在融后稀釋20倍時,仍能保持5×105/ml數(shù)量。
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Anip973細胞,人肺腺癌細胞株接種或傳代以后,實驗者每天或至多間隔1~2d,要對細胞做常規(guī)性檢查。觀察細胞形態(tài)和生長情況以及培養(yǎng)的pH變化、有無污染等。根據(jù)細胞動態(tài)變化,做換液或傳代處理,如發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時采取措施。1. 細胞形態(tài) 生長狀態(tài)良好的細胞,在一般顯微鏡下觀察時可見,細胞透明度大、折光性強、輪廓不清。細胞生長不良時,輪廓增強,胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物,細胞之間空隙加大,細胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點,如上皮細胞變成類上皮細胞等。某些染料當細胞死亡時能透過變性的胞膜與解體的細胞核DNA結(jié)合,而令其著色。因而常用臺盼藍(trypan blue) 鑒別細胞死活,活細胞不著色,死細胞核呈藍色。2. 細胞生長 初代培養(yǎng)或傳代的細胞懸液接種以后,經(jīng)過長短不同的潛伏期后開始增殖。傳代細胞系、胚胎組織或幼體組織一般在第二天即可見細胞生長,一周內(nèi)便可連接成片。接種細胞長滿瓶壁后,應(yīng)及時做再培養(yǎng)。否則由于營養(yǎng)物消耗和代謝積累,細胞即進入停止期或退化期。此時細胞輪廓增強,細胞內(nèi)常出現(xiàn)顆粒狀堆積物,為膨脹的線粒體,細胞質(zhì)呈空泡化,細胞變圓、粗糙,嚴重時細胞從瓶壁脫落,只有及時再做傳代處理,才能使細胞繼續(xù)生長繁殖。3. 營養(yǎng)液 正常情況下,培養(yǎng)液呈桃紅色。如果細胞維持在pH6.5~6.6條件下,細胞會脫落死亡。當培養(yǎng)液酸化變黃時,說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量,需要更換新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中如加Hepes或用5%CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持相對穩(wěn)定。更換營養(yǎng)液的時間,可依營養(yǎng)物的消耗而定,細胞生長旺盛時2~3d換一次,生長緩慢時,3~4d亦可。要特別注意各種細胞對pH值要求是不一樣的。4. 微生物污染 微生物污染培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物后會出現(xiàn)pH值改變,培養(yǎng)液呈現(xiàn)混濁狀。細菌感染后,由于細菌的運動,光鏡觀察可見有微閃光;真菌感染則在鏡下見許多細絲狀菌絲,有時還密集有群集孢子;支原體的污染需要借助一些檢測手段才可檢出。細胞污染以后一般應(yīng)當廢棄,對于重要的細胞株,可以參考相關(guān)專著,介紹采取一些措施清除污染。比較重要的實驗、珍貴的細胞,至少由兩個實驗人員獨立培養(yǎng)操作,或由一個人分次(不同時)操作。除培養(yǎng)實驗室的衛(wèi)生條件外,空氣中的濕度與微生物污染關(guān)系密切。重要的、周期長的實驗盡量安排在空氣濕度低的秋冬季進行。
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