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大鼠15-脂加氧酶(15-LO)ELISA試劑盒操作方法:
一、雙抗體夾心法
1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃ 。次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。
2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。
3. 加酶標抗體:于各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小時,洗滌。
4. 加底物液顯色:于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分鐘。
5. 終止反應:于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調零后測各孔OD值,若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。
二、間接法
1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃;
2.次日洗滌3次;
3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌;
4.(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml;
5.37℃孵育35-60分鐘,洗滌;
6.zui后一遍用DDW洗滌。
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
大鼠15-脂加氧酶(15-LO)ELISA試劑盒標本收集:
血清:全血標本于室溫放置2小時或4℃后于1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,收集血液的試管應為一次性的無熱原,無內毒素試管。血漿:抗凝劑推薦使用EDTA,標本采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測。避免使用溶血,高血脂標本。其它生物標本:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測標本應清澈透明,懸浮物應離心去除。標本收集后若不及時檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20℃/-80℃電冰箱內,避免反復凍融,6個月內進行檢測,4℃保存的應在1周內進行檢測。 如果樣本中檢測物濃度高于標準品zui高值,請根據實際情況,做適當倍數稀釋(建議先做預實驗,以確定稀釋倍數)。
酶標儀(450nm波長濾光片)高精度移液器,EP管及一次性吸頭:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL,200-1000μL37℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水。
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