1.標準品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋）：
 12μg/L （5號標準品） 120μl的原倍標準品加入120μl的標準品稀釋液
6μg/L （4號標準品） 120μl的5號標準品加入120μl的標準品稀釋液
3μg/L （3號標準品） 120μl的4號標準品加入120μl的標準品稀釋液
 1.5μg/L （2號標準品） 120μl的3號標準品加入120μl的標準品稀釋液
 0.75μg/L （1號標準品） 120μl的2號標準品加入120μl的標準品稀釋液
2.分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準品孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品孔中加入稀釋好的標準品50μl；在3.酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。輕輕晃動混勻，37℃溫育30分鐘。  
4.棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復5次，拍干。
5.每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。輕輕晃動混勻，37℃溫育30分鐘。 
6.棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復5次，拍干。
7.每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
8.取出酶標板，每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
9.測定：以空白孔調零，在450nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
 根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來10.計算。應記住由于樣品稀釋了的，其實際濃度應該乘以總稀釋倍數(shù)。