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使用豚鼠白介素1受體拮抗劑(IL1Ra)ELISA試劑盒操作步驟

發布時間:2012-06-08瀏覽:1622次

  樣本處理及要求:
  
  1.血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離

心。
  
  2.血漿:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集

上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。
  
  3.尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水

、腦脊液參照實行。
  
  操作步驟:
  
  1.標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,在*、第二孔中分別加標準品100μl,然后在*、第二孔中加

標準品稀釋液50μl,混勻;然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液

50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標準

品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μ

l,混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中

各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為60ng/L,40ng/L,20ng/L,10ng/L,5ng/L)。
  
  2.加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先

加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動

混勻。
  
  3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
  
  4.配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用。
  
  5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。
  
  6.加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。
  
  注意事項:
  
  1.試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。
  
  2.濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
  
  3.各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內,如標本數量多,推

薦使用排槍加樣。
  
  4.請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值),請先用樣

品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時請zui后乘以總稀釋倍數(×n×5)。
  
  5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
  
  6.底物請避光保存。
  
  7.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
  
  8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
  
  9.本試劑不同批號組分不得混用。

  實驗原理:
  
  本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中豚鼠白介素1受體拮抗劑(IL1Ra)水平。用純化的豚鼠白介素1受體拮抗劑(IL1Ra)抗體包

被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入白介素1受體拮抗劑(IL1Ra),再與HRP標記的IL1Ra抗體結合,形成抗體-抗

原-酶標抗體復合物,經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色

的深淺和樣品中的白介素1受體拮抗劑(IL1Ra)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中豚鼠

白介素1受體拮抗劑(IL1Ra)濃度。
 

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