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UMRC2細(xì)胞,傳細(xì)胞培養(yǎng)
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UMRC2細(xì)胞,傳細(xì)胞培養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)步驟1]
1、準(zhǔn)備工作:1)肥皂洗手,在進(jìn)行無(wú)菌操作前,用75% 的酒精擦拭雙手,注意指間,和指甲周?chē)?。同時(shí),用酒精棉球擦拭超凈臺(tái)。2)將培養(yǎng)液放置室溫,備用。3)打開(kāi)超凈臺(tái)內(nèi)的紫外燈,照射20 min。同時(shí),將實(shí)驗(yàn)所需材料也放入超凈臺(tái)進(jìn)行滅菌(血清、培養(yǎng)基除外)4)倒置顯微鏡下,觀察細(xì)胞的狀態(tài),是否已經(jīng)長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶,需要進(jìn)行分瓶。
2、關(guān)閉超凈臺(tái)的紫外燈,打開(kāi)風(fēng)機(jī)。
3、點(diǎn)燃酒精燈,取出刻度吸管,在火焰上略燒,然后,安上吸球待用。
4、在打開(kāi)培養(yǎng)瓶之前,用酒精棉球擦拭瓶蓋,打開(kāi)后,瓶口在酒精燈上過(guò)火焰,再用吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液,注意,吸管不要碰到布滿(mǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)瓶的側(cè)壁。
5、將胰酶加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),顯微鏡下隨時(shí)觀察,見(jiàn)到細(xì)胞的突起消失,變圓時(shí),立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,吸出胰酶。記住不要消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng),否則,細(xì)胞會(huì)被胰酶消化掉。
6、加入適量Hanks液或培養(yǎng)基清洗一遍,立即倒掉。
7、加入含有10%血清的培養(yǎng)基,用吹打管吹打,一定要輕輕吹打,使其從瓶壁上脫落分散到培養(yǎng)基中,再補(bǔ)加培養(yǎng)基,按1:3進(jìn)行分瓶。然后,用火焰燒培養(yǎng)瓶的瓶口和蓋,再蓋好培養(yǎng)瓶的蓋,放到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
以上介紹的是貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法,對(duì)于懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法,只需要將細(xì)胞進(jìn)行離心,1000 rpm,5 min,然后,換入新的培養(yǎng)基即可。再分裝到不同的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。
不健康的細(xì)胞質(zhì)中有空泡,細(xì)胞內(nèi)有顆粒樣物質(zhì),細(xì)胞間空隙增大,變形,不規(guī)則,失去原有的特點(diǎn)。
4. 是否污染:
傳代或換液24~ 48 h注意觀察細(xì)胞是否被污染,污染的細(xì)胞培養(yǎng)液變渾濁,鏡下可見(jiàn)有大量菌絲。如果細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,生長(zhǎng)特性改變,胞質(zhì)內(nèi)顆粒性物質(zhì)增多,盡管培養(yǎng)液不變渾濁,考慮可能有支原體污染。污染的細(xì)胞立即從培養(yǎng)箱中取走,以免污染其它細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)四、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
UMRC2細(xì)胞,傳細(xì)胞培養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)步驟2]
1. 為了保證細(xì)胞良好的狀態(tài),在細(xì)胞凍存的前一天使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,同時(shí)將細(xì)胞換液,次日,按照細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法,用胰酶消化貼壁細(xì)胞,將細(xì)胞用培養(yǎng)基沖下來(lái),然后,用50 mL尖底離心管離心,1000 rpm,4min,棄上清,收集細(xì)胞。
2. 加入適量的凍存液(10% DMSO 和 90%含有20%血清的IMDM培養(yǎng)基)
3. 分裝到凍存管中,做好標(biāo)記,標(biāo)明細(xì)胞名稱(chēng),保存時(shí)間,所用培養(yǎng)基等。
4. 4℃放置30 min;-20℃放置1.5 h; -70℃放置12 h;zui后移到液氮罐中。
細(xì)胞的復(fù)蘇:
細(xì)胞的復(fù)蘇原則是快速溶化,因?yàn)槿绻徛娜芑?,?huì)使進(jìn)入細(xì)胞的水分形成冰晶,對(duì)細(xì)胞造成傷害,因此,在復(fù)蘇細(xì)胞時(shí),將凍存細(xì)胞直接放到37℃的水浴中,使其迅速溶解。在超凈臺(tái)內(nèi)將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸浮液直接倒入小培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi),然后,加入3 mL的培養(yǎng)液。次日,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,并更換細(xì)胞培養(yǎng)液。
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